【48812】天大团队全基因组水平辨认解脂酵母耐受糠醛和乙酸新靶点

  木质纤维素生物质是丰厚、清洁的可再生资源，被视为可继续出发生物燃料和生物化学品的重要潜在质料。解脂耶氏酵母因其安全性和代谢可塑性成为新式的组成生物学底盘菌，并能够以木质纤维素水解液为质料出产多种高的附加价值化学品。可是，木质纤维素水解液中两种首要按捺剂糠醛、乙酸的存在严峻约束了解脂酵母对这一资源的使用，因而火急地需求进步解脂酵母对糠醛和乙酸的耐受性。因为微生物的代谢网络扑朔迷离，其对有毒物质的耐受性通常是多个生化进程归纳调控的成果；而现有研讨对与耐受相关的代谢进程了解缺乏，耐受性的进步也随之遭到阻止。

  近期，天津大学团队在 Bioresource Technology 期刊在线宣布了题为“Mining novel gene targets for improving tolerance to furfural and acetic acid in Yarrowia lipolytica using whole-genome CRISPRi library”的研讨，报导了天津大学曹英秀课题组在全基因组水平辨认解脂酵母耐受糠醛和乙酸新靶点，并解析要害靶点的耐受机理。天津大学化工学院博士后房立霞、博士陈雅如、硕士贺千禧为该论文的一起榜首作者，曹英秀副教授为该论文的通讯作者，其致力于从全基因组水平体系地辨认潜在耐受靶点，开释解脂酵母使用木质纤维素水解液的潜能。

  根据 CRISPR 的全基因组文库挑选已被用于在大肠杆菌、酿酒酵母等形式微生物中开掘新基因靶点并树立相应的基因型-表型联系。在解脂酵母 PO1f 中，曾经的研讨也现已树立了靶向其全基因组的 CRISPR-Cas9 文库，并成功用于辨认高产脂质靶点。可是，CRISPR-Cas9 文库会形成靶向的基因功能损失，然后不适用于研讨必需基因，也无法发生多种基因调控水平。根据 CRISPR 搅扰（CRISPRi）的文库答应不同程度的下调而不是彻底损坏基因，然后保证靶点发掘规模更大、灵活性更强。本文作者使用CRISPRi文库发掘解脂酵母全基因组中与糠醛、乙酸耐受性相关的新基因靶点，完成对两种按捺剂耐受性的进步，并解析了要害靶点的耐受机理。

  首要，作者在解脂酵母中树立了全基因组的 CRISPRi 文库，并成功挑选出 14 个与糠醛、乙酸耐受性相关的新基因靶点。经过将 dCas9 蛋白与曾经研讨成果中靶向解脂酵母 PO1f 全基因组的 sgRNA 相结合，作者初次在解脂酵母中树立了全基因组的 CRISPRi 文库。经过文库组成、转化、挑选等进程（图 2a），对富集度（挑选后测序读数与挑选前测序读数的比值）最大的多个 sgRNA（以糠醛为按捺剂挑选时，在 2 种不同的数据处理办法中各挑选富集度前 10 的 sgRNA；乙酸挑选同理）进行反应验证，终究得到 7 个与糠醛耐受相关的基因靶点，相应的基因转录按捺工程菌能够在 3.6mM 的糠醛浓度下完成显着成长，基因敲除工程菌能够在 4.8mM 的糠醛浓度下显着成长（图 2b）；得到 7 个与乙酸耐受相关的基因靶点，相应的工程菌能够在 0.35% (v/v)的乙酸浓度下显着成长（图 2c），这是据咱们所知解脂酵母能耐受的最高乙酸浓度。而且，没有以往的研讨显现这 14 个基因与糠醛、乙酸耐受性有关，阐明咱们得知了耐受新靶点。

  然后，作者将糠醛、乙酸耐受靶点进行组合转录按捺，以一起耐受两种按捺剂。工程菌F19-A19（转录按捺基因YALI1_A06958g和YALI1_F12842g）在 2.4mM 糠醛加 0.15% (v/v)乙酸的两层按捺剂中成长作用最好（图 3a）；而在没有按捺剂的条件下 F19-A19 与对照菌的成长情况简直彻底相同（图 3b），标明转录按捺靶点的确进步了工程菌对按捺剂的耐受性而不是无压力常态下的成长才能。

  基因 YALI1_A06958g 的功能与 Rho 蛋白活性调理有关，作者估测其转录按捺促进了 Rho 蛋白进入活性情况并激活了下流的细胞分裂进程（图 3c），细胞在糠醛环境下的成长才能随之进步。蛋白组学和转录组学剖析成果为，在转录按捺基因 YALI1_A06958g 的工程菌 F19 中，参加 Rho 蛋白激活的 GEF 蛋白与对照菌比较表达上调了将近 150 倍，且 22 个与细胞分裂直接相关的基因的表达也得到十分显着上调（图 3d），契合对转录按捺 YALI1_A06958g 进步糠醛耐受性的机理的假定。

  基因 YALI1_F12842g 编码一种丙酮酸激酶，作者估测其转录按捺能够发生更多的 3-磷酸甘油醛进入磷酸戊糖途径，由此发生更多的 NADPH 以铲除乙酸形成的氧化损害（图 3e），细胞对乙酸的耐受性随之进步。经过丈量发现，转录按捺基因 YALI1_F12842g 的工程菌 A19 与对照菌比较， NADPH 水平更高而活性氧水平更低（图 3f），契合对转录按捺 YALI1_F12842g 进步乙酸耐受性的机理的假定。

  以上研讨在以葡萄糖为仅有碳源的培育环境中进行，而木质纤维素水解液中另一种首要碳源木糖的使用相同需求咱们来重视。作者经过异源表达来自 S. stipitisd 菌的基因 SsXYL1 和 SsXYL2，以及过表达解脂酵母内源的基因YlXYL1 成功构建了解脂酵母木糖使用菌（图 4a）。在以木糖为仅有碳源的条件下对 14 个耐受靶点来测验，发现转录按捺基因 YALI1_A07632g 的工程菌 F4-XYL 和转录按捺 YALI1_C20198g 的工程菌 A7-XYL 分别在3.6mM 的糠醛和 0.35% (v/v)的乙酸中仍能表现出杰出的成长情况（图 4b）。

  综上，作者使用初次在解脂酵母中树立的全基因组 CRISPRi 文库，发现了7 个与糠醛耐受性相关和 7 个与乙酸耐受性相关的新基因靶点，终究完成了葡萄糖和木糖双碳源共使用条件下对 2.4mM 糠醛加 0.2% (v/v)乙酸的耐受。首要靶点转录按捺引起耐受的机理被估测为与促进细胞分裂和削减活性氧含量有关。本研讨加深了对按捺剂和细胞代谢之间相互作用的了解，有助于解脂酵母对木质纤维素水解液的高效使用，然后推进了绿色生物制作。该研讨取得国家重点研制方案（2021YFC2104400）和国家自然科学基金（NSFC 22078240）的赞助。